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對酶的測定十分重要，過高雖然測定的線性較寬，但重復性差，反之精密度雖好，但檢測線性窄，因此應根據實際情況進行合理的設置和應用。但是在臨床實際工作中，儀器諸多因素如波長的準確性半波寬的大小比色杯光徑及磨損與清潔度溫控的準確性加樣系統狀況等若不符合要求或發生變化都會影響指示物的ε值或上述公式中的相關項，因此應在具體儀器條件下，定期檢查和實際測定指示物的實測ε值和F值。因為純NADPH溶液不穩定，所以NADPH的ε值需用葡萄糖己糖激酶法實測，實際操作為將某一濃度的葡萄糖溶液重復-次測定，得到相應的一組吸光度A值，求出Aˉ±s，注意s必須低于規定的批內允許值，再根據下面兩個公式分別計算出NADPH的實測ε值和F值式中C為標準液濃度mol/L。
其他一些色素源指示物在不同的介質環境中，其ε值會發生程度不等的變化，對-硫代--硝基苯甲酸對硝基苯酚對硝基苯胺等這些可得到高純而穩定的指示物，可將其配制在一定的介質中，按臨床標本用的現場試劑和儀器測定吸光度求實測ε值及F值。線性度是非線性比率的界線，常用%表示，其計算公式為，式中k為連續監測時間/內前讀數時間的斜率，k為后/讀數時間的斜率，k為總的斜率，一般設置為%。對一些酶活性項目，可以適當放寬，當不需要設置檢查界限時，設置其為。
線性百分數大，說明Δk之間已不成線性；超過極限值說明底物不足，檢測結果會變低，應稀釋后重測。底物耗盡限額選擇連續監測法或兩點終點法時設置，不同型號分析儀的設計不一樣，有的為零點與監測點吸光度的差額，有的為吸光度上升或下降至指定吸光度MAX-OD/MIN-OD的數值。超過限額說明樣品的酶活性非常高，底物消耗太快，在儀器程序規定的線性反應期內吸光度的變化往往不代表真正的酶活力，導致結果偏低，該樣品應稀釋一定的倍數重新測定。
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